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荧光定量pCr详细步骤

博凌科为-为你解答:如果lz确实已经确定该基因snp位点以及突变型,你可以选择荧光定量pcr进行检测,检测方法是:1、探针设计在突变位置,有几个突变点设计几个(不同突变型需要不同的荧光标记:例如,野生型探针用fam、其中一个突变

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

变性→退火→延伸三个基本反应步骤,答:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析.随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加.我们实验室用BIOG 染料法荧光定量PCR和BIOG探针法荧光定量PCR测得的扩增曲线起跳值一般在30左右,每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图.

首先是获取菌体,再提总RNA,不用再分离mRNA,直接做反转录RT-PCR,得到cDNA后直接进行荧光定量PCR.得到的得到cDNA可以保存的时间比较长.这样荧光定量PCR就可以集中一起做.

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料.原理: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.

研究人员常常需要检测特定基因的表达水平,检测的手段很多,主要有Northern, 半定量RT-PCR, 荧光定量PCR(real time PCR),基因芯片的手段.很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点. Northern方式比较直观,但是难以批量进行,劳动

荧光定量pcr常用的是什么方法用已知浓度的DNA样本(通常是质粒)梯度稀释成一系列的样本.做实验的时候,这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内.一起做PCR.标准品的荧光强度和已知的浓度作图,可以得到一条标准曲线.而待测样本的荧光强度测出以后,就可以在标准曲线上算出样本浓度了.

设计引物探针,购买与探针标记相应的荧光定量PCR试剂盒,按照荧光定量PCR仪的设置要求配制相应体积的包含酶及buffer的反应液,加入上下游引物和探针,最后加入扩增模板,放入仪器,设置反应参数,开始运行,结束后按照仪器记录的数据进行分析.

三步法PCR 首先95°C 作用3 min. PCR 进行 35 个循环. 步骤 温度 变性 95°C 退火 58°C 延伸 72°C 时间 30 秒 30 秒 30 秒 融解曲线 温度 时间 变温速度 95°C 0秒 20°C/秒 55°C 15 秒 20°C/秒 95°C 0秒 0.1°C/秒 PCR 疑难解答 当 PCR 结果

说下我自己做的,感觉的注意事项,仅供参考1.实验设计要合理.很重要2.加样时力求准确,以减小偏差3.引物设计得好4.

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